Caracterización molecular de gametocitos de Plasmodium vivax

De forma tal de desarrollar nuevas herramientas para la caracterización y detección de la carga sub-patente de gametocitos de Plasmodium vivax, utilizamos una aproximación de bioinformática para detectar ortólogos de genes de P.falciparum, identificar y caracterizar marcadores putativos de gametocitos de P. vivax en primates no-humanos (NHP).  Para esto diseñamos cebadores moleculares exon-exon y sus respectivos oligos de cDNA de 15 marcadores candidatos para optimizar una prueba de qRT-PCR Fast SyberGreen® para tamizar y caracterizar gametocitos derivados de P. vivax adaptado a NHP preservados en Trizol® o depositados en laminillas para inmunofluorescencia indirecta (IFA).  Para esto ultimo generamos anticuerpos policlonales péptido-específicos en conejos para detectar gametocitos de P. vivax AMRU-1 y SAL-1 en muestras infectadas de Aotus.  Dos marcadores putativos de gametocitos (PVX_117900 [proteína hipotética de estadios tardíos de gametocitos] y PVX_117730 [proteína phosphatase 2C putativa de estadios tardíos de gametocitos]), y el gen constitutivo marcador (PVX_091645) y el marcador conocido Pvs25  (PVX_111175) demostraron un coeficiente de regression optimo y curvas de reacción eficientes durante la optimización y validación de la prueba de qRT-PCR.  La expresión de ambos genes PVX_117900 and PVX_117730, marcadores genéticos putativos de gametocitos se detectaron en muestras de sangre infectada de Aotus con P. vivax en 12-15 días post-inoculation. De la misma manera, se detectaron células con la morfología de gametocitos de sangre completa filtrada en columnas de CF11 o cultivos ex-vivo de bandas obtenidas en gradientes de Percoll tenidas con Giemsa.  El anticuerpo PVX_117900 policlonal marco células con la morfología de gametocitos tardíos asi como también de gametocitos tempranos putativos, sugiriendo que esta proteína se expresa a través de la gametogenesis.  Utilizando los mismos anticuerpos se detectaron parásitos compatibles con macro y micro gametocitos en ex flagelación por IFA en bandas de gradientes de Percoll de cultivos ex-vivo a las 48 horas post-inoculación.   Interesantemente, el mismo marcador también marco una pequeña fracción de esquizontes de P. vivax de los cultivos ex-vivo de parásitos derivados de Aotus mientras que anticuerpos contra el marcador de estadios sanguineo PvAMA-1 marco todos los esquizontes. Esto sugiere que PVX_117900 podría también detectar esquizontes acometidos para producir gametocitos.  Experimentos adicionales para el seguimiento longitudinal de la densidad de gametocitos en Aotus infectados, utilizando la cepa de P. vivax AMRU-1 resistente a la cloroquina (CQ), nos permitió por primera vez seguir la dinámica de la gametocitogénesis en un modelo de NHP, validando la utilidad del modelo P. vivax Aotus/AMRU-1 CQ resistente para la el estudio de gametocitogénesis in vivo.   En conclusion, en el segundo objetivo identificamos dos marcadores nobeles putativos de gametocitos de P. vivax (PVX_111179 and PVX_117300).  Específicamente, la expresión génica de gametocitos se caracterizo utilizando un prueba altamente sensitiva de qRT-PCR en la sangre de Aotus inoculados experimentalmente. De las misma manera, la microscopia de IFA utilizando el anticuerpo policlonal PVX_117900 permitió la detección de gametocitos de P. vivax de manchas de sangre en laminillas para IFA de NHP primates infectados.  Este marcador nobel putativo de gametocitos es un candidato para el desarrollo futuro de una vacuna de bloqueo de la transmisión.  La segunda fase de este proyecto contempla la caracterización de 8 marcadores putativos adicionales en tejidos infectados con P. vivax.

 Validación de una prueba molecular ultra-sensitiva de qRT-PCR para la detección de gametocitos de Plasmodium vivax en pobladores de áreas endémicas de Panamá

A medida que avanza la eliminación de la malaria en Meso-América y con un menor número de casos por año, la detección de pacientes asintomáticos, utilizando metodos de diagnóstico convencionales se torna mas dificil. El desarrollo de una prueba de detección molecular altamente sensitiva qRT-PCR para la detección de gametocitos y determiner el reservorio asintomatico es clave para detener la transmisión de P. vivax y lograr su eliminación de las zonas endemicas. El objetivo de esta propuesta es el de validar una prueba molecular ultrasensitiva para la detección de gametocitos de P. vivax en individuos asintomaticos. En esta primera fase hemos obtenido la aprobación del protocolo por el Comite de Bioética del ICGES; así como cotizar y adquirir equipos, reactivos, materiales e insumos de laboratorio; confeccionar y probar un formulario epidemiológico electrónico de captura de datos en tiempo real vía internet; determinar los sitios de colección de muestras y sostenido reuniones con autoridades del ICGES y la Dirección General de Salud del MINSA incluyendo los Directores de Control de Vectores, Red de Laboratorios de Salud Publica y de Enfermedades Desatendidas y del Adulto Mayor para explicar el propósito y el alcance de la investigación.

Optimización de cultivos ex-vivo de Plasmodium vivax derivados de Aotus

 El Plasmodium vivax ha demostrado ser difícil de mantener en cultivo continuo, principalmente a condiciones especiales de cultivo y su preferencia por invadir reticulocitos. Hasta ahora, se han ensayado diferentes medios de cultivo empíricos en cultivos ex vivo de P. vivax con relativo éxito, pero una composición definitiva permanece esquiva. Con el fin de mejorar la viabilidad de los cultivos ex vivo de P. vivax, examinamos el efecto del medios de cultivo de McCoy suplementándolo con concentrado de lípidos o GlutaMax ™ (modificado McCoy), solos o en combinación sobre la viabilidad eritrocitos de Aotus infectados (iRBCs). Para este propósito, hemos probado el efecto del medio McCoy modificado sobre los cultivos ex vivo de veintidós (22) Aotus. La suspensión de iRBCs se sembró e incubó a 37ºC en una cámara de gas bajo una atmósfera de 5% de O² + 5% de CO² y 90% de N² en condición estática. El medio se cambió a las 24 horas y las células se cosecharon a las 48 horas. Se prepararon frotis finos a las 0, 24 y 48 horas PI y se tiñeron con Giemsa para la determinación de parasitemia (%) y estadios. Al final de las 48 horas de incubación, las muestras se conservaron en Trizol para estudios de expresión génica de marcadores de gametocitos y se prepararon laminillas para IFA. El aumento de la viabilidad se definió como cultivos ex vivo con parasitemias estadísticamente diferentes (p <0.05) comparados contra el control (Suero sólo) a las 48 horas de incubación. Los datos obtenidos a partir de estos experimentos indican que la viabilidad de los cultivos ex vivo se potenció mediante los medios McCoy modificados independientemente de su estado de filtración de WBCs. Además, los datos sugieren que la suplementación de los medio de cultivo McCoy con concentrado de Lípido solo o en combinación con GlutaMax fue superior al cultivo con McCoy suplementado solo con suero humano.  Actualmente nos encontramos analizando la expresión génica de marcadores de gametocitos obtenidos durante los cultivos a las 48 horas de incubación y realizando cultivos ex vivo adicionales suplementados con medio IMDM.

 Inducción de protección por infecciones repetidas contra el desafío sanguíneo con cepas homólogas y heterólogas de Plasmodium vivax en el modelo Aotus / P. vivax

Los antígenos de la fase sanguínea AMA1 y MSP142 han demostrado individualmente que inducen respuestas inmunitarias parcialmente protectoras en los monos Aotus, una especie de primate del Nuevo Mundo que soporta el desarrollo de estos parásitos en fase sanguínea; La inmunización con P. falciparum AMA1 protege retardando el periodo pre-patente o produciendo picos de parasitemia bajos, mientras que las inmunizaciones con P. vivax y P. falciparum MSP1 proporcionaron diversos grados de protección en este modelo. La proteína AMA1 también ha inducido protección en seres humanos: cuando se administró como proteína recombinante, en un esquema sensibilización con plasmidos de DNA / y un boost de adenovirus recombinante con la proteína  del circunsporozoito (CSP) que protegió de forma estéril el 27% de los individuos en una infección controlada con el paludismo humano.  MSP1, has sido también administrada como una proteína recombinante, induciendo respuestas de anticuerpos en seres humanos que son capaces de inhibir la invasión de los parásitos in vitro y cuando se administra mediante un adenovirus recombinantes.  En la actualidad no hay un punto de referencia para evaluar el nivel de protección (celular y humoral) que se necesita para lograr una protección completa o estéril contra un desafío heterólogo en Aotus o en sujetos humanos. Nuestro estudio pretende abordar esta cuestión comparando el efecto de las infecciones repetidas sobre las respuestas inmunes celulares y humorales frente a antígenos de estadios sanguíneos tales como AMA1 y MSP142 correlacionándolos con la parasitemia, hasta lograr una protección parcial o estéril de un desafío heterólogo de P. vivax. Los resultados de este experimentos nos permitirán evaluar la eficacia protectora de las vacunas candidatas P. vivax experimentales en el modelo de desafío con infección sanguínea de P. vivax / Aotus.

 Diversidad genética y estructura poblacional de los aislados de campo de Plasmodium vivax panameño utilizando secuenciación complete del genoma

La malaria por Plasmodium vivax es una de las principales causas de morbilidad en Panamá y América Latina. Desafortunadamente, poco se sabe sobre su estructura geográfica genotípica. Los hallazgos recientes de la extensa diversidad genética de los aislamientos de P. vivax de Colombia y la existencia de dos haplotipos distintos de Anopheles albimanus segregandos a ambos lados del Canal de Panamá nos llevaron a proponer aquí la caracterización de la diversidad genética de los aislados de P. vivax en circulación mediante la secuenciación completa del genoma (WGS).  Nuestra hipótesis plantea la existencia de baja diversidad entre los parásitos P. vivax panameños que se superponen a los de A. albimanus a ambos lados del Canal de Panamá.  Para este propósito, planeamos recolectar los aislamientos de P. vivax en circulación en el país y determinar su diversidad genética y estructura geográfica usando WGS. Si los vectores están causando la estructura en la población P. vivax de Panamá, examinaremos los loci asociados con interacciones vectoriales como Pvs47, calculando las medidas de la estructura de la población en un enfoque basado en genes y basado en ventanas a través del genoma, con el objetivo de identificar loci con alta divergencia. En caso de que este estudio demuestre una baja diversidad y estructura causada por el vector, sugiere que Panamá se encuentra en etapa de pre-eliminación de la malaria. Esperamos que los resultados de este estudio ayuden a implementar y adaptar un programa de eliminación / erradicación de la malaria para Panamá y Mesoamérica que impactará directamente en la salud de las personas de bajos ingresos que viven en las regiones endémicas de paludismo.

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